Vorbereitung

• 25 cm² Kulturflaschen
• Falcons
• 10 µl-Pipette (mit Ethanol abwischen)
• 1000 µl-Pipette (mit Ethanol abwischen)
• sterile Eppis (1,5 ml)
• 5 ml Sterilpipetten
• Pipettenspitzen blau und kristall
• Abfallbehälter für Zellen und Pipettenspitzen
• Medium TNM-FH mit 10% FCS oder Grace's Insect Medium + 10%FCS + AB
• Sf9-Zellen, 1*10⁶
• Transfektionspuffer A und B
• Virus-DNA 0,25 µg
• Plasmid-DNA 1 µg

Durchführung

1× Nullwert (ohne Plasmid-DNA und Virus-DNA), 1× Transfektion

1. Kulturflaschen mit 3 ml Medium benetzen
2. Sf9-Zellen dazugeben, verteilen
3. 15 min absorbieren lassen
4. unter dem Mikroskop kontrollieren
5. zwischendurch: Virus-DNA und Plasmid-DNA in ein Eppi geben, durch "Schnippen" mischen, 5 min stehenlassen
6. Nullwert:
   1. Medium absaugen
   2. 0,5 ml Transfektionspuffer A seitlich in die Flasche geben
   3. 0,5 ml Transfektionspuffer B tropfenweise seitlich in die Flasche geben (je 2 Tropfen, schwenken)
7. Transfektion:
   1. Medium absaugen
   2. 0,5 ml Transfektionspuffer A seitlich in die Flasche geben
   3. 0,5 ml Transfektionspuffer B in Eppi mit DNA geben, tropfenweise seitlich in die Flasche geben (je 2 Tropfen, schwenken)
8. bei 27°C im Brutschrank für 4h inkubieren, stündlich Flasche schwenken
9. Medium absaugen und durch 2,5 ml frisches Medium ersetzen
10. 5 Tage bei 27°C im Brutschrank inkubieren
11. 1. Überstand abnehmen, zur Kontrolle im Kühlschrank aufbewahren, zentrifugieren bei 2300 rpm, 10 min, RT, →Plaque-Assay
12. 2,5 ml frisches Medium dazugeben
13. 2 Tage bei 27°C im Brutschrank inkubieren
14. Zellen abschlagen
15. zentrifugieren bei 2300 rpm, 10 min, RT
16. 2. Überstand abnehmen, zur Kontrolle im Kühlschrank aufbewahren, →Plaque Assay